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公司新聞

常年產(chǎn)品工藝開(kāi)發(fā),放大生產(chǎn),產(chǎn)品定制皂苷黃銅生物堿

2015-12-30

        生物堿的分離方法的確很多,既有經(jīng)典的分離方法,如溶劑萃取法、蒸餾法、沉淀法、鹽析法、結晶法、膜滲透升華法等,也有較為現代、先進(jìn)的分離方法,如色譜分離法。

  1.硅膠柱色譜分離法

  硅膠柱色譜分離法主要利用二氧化硅作為填料,是較為常用的柱色譜分離方法。硅膠為中性無(wú)色顆粒,其性能穩定。硅膠層析柱適用范圍廣,既能用于非極性生物堿也能用于極性生物堿,且成本低,操作方便,是常見(jiàn)的生物堿的分離方法。

  2.氧化鋁柱色譜分離法

  氧化鋁柱色譜分離法是以氧化鋁作為填料的層析分離法,適合于酸性大、活化溫度較高的生物堿的分離。比如采用氧化鋁層析方法正向分離非酚性粉防己堿與粉防己若林堿,其Rf值適中,展開(kāi)后放置10min以顯色劑噴濕潤效果為最好、且穩定,可得到較好的效果。這種柱色譜分離法也是較為常用的生物堿分離的方法之一。這是由于許多生物堿極性較小,氧化鋁對它們吸附較小,而雜質(zhì)常被吸附。

  3.離子交換樹(shù)脂分離法

  離子交換樹(shù)脂對吸附質(zhì)的作用主要是通過(guò)靜電引力和范德華力達到分離純化化合物的目的。隨著(zhù)人們對生物堿的認識和了解,離子交換樹(shù)脂已應用于生物堿的分離提取中。離子交換技術(shù)有設備簡(jiǎn)單、操作方便、生產(chǎn)周期短、能源消耗少、成本低、產(chǎn)品純度高、不吸潮、不加輔料就可以成型等特點(diǎn)。而傳統的水煮法和水醇法提取分離得到的制劑總是又黑、又大、又粗,使用極不方便;有機溶劑萃取方法,溶劑用量大,環(huán)境污染嚴重。因而離子交換樹(shù)脂法在生物堿的提取、分離的研究與生產(chǎn)中應用日益廣泛。

  4.高速逆流色譜分離法

  高速逆流色譜分離法(high speed coutercurrent chromatography,簡(jiǎn)稱(chēng)HSCCC)是一種新的分離技術(shù),它對生物堿的分離和制備具有很大的優(yōu)勢,特別是對進(jìn)樣量較大的樣品具有獨特的優(yōu)點(diǎn),其應用前景越來(lái)越引人注目。

     

 

 

      經(jīng)過(guò)前期對多糖的提取,去除蛋白質(zhì)、色素、小分子等物質(zhì)得到粗多糖,而這些粗多糖其實(shí)是由很多分子量、結構不同的多糖混合而成。為了得到純的多糖即均一性多糖,仍需進(jìn)一步對這些粗多糖進(jìn)行分離純化。

  1、分步沉淀法

  多糖的結構和分子量不同,其極性大小不同,在有機溶劑(如醇或酮)中的溶解度不同,根據這一原理,可以依此增加醇濃度,從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來(lái)。但是分級沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱層析法等進(jìn)一步純化,方可得到均一性的多糖。

  2、柱層析法

  要獲得均一性的多糖,一般是先經(jīng)過(guò)陰離子交換柱進(jìn)行粗步純化,然后再用凝膠柱進(jìn)一步純化。有些多糖也采用大孔樹(shù)脂柱進(jìn)行純化。下面對這三種柱層析法進(jìn)行詳細介紹。

  3、陰離子交換法

  一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類(lèi)和高等植物的多糖進(jìn)行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質(zhì)有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱對大杯香菇等菌類(lèi)、玉米等植物、桑黃等藻類(lèi)粗多糖進(jìn)行分離純化。使用DEAE-52填料進(jìn)行多糖的初步分離純化,該柱子一般直徑偏大,其中以2.6cm最多,操作過(guò)程中流動(dòng)相的流速也較快,流速一般在0.7-2ml/min之間,以1ml/min最多,至于柱子的長(cháng)度,選擇范圍較廣,從25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在對菌類(lèi)、植物和藻類(lèi)粗多糖的初步分離純化中,在選擇層析柱的直徑、流速和長(cháng)度的方面與DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流動(dòng)相都是純水和不同濃度的NaCl溶液。

  4、凝膠色譜法

  凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關(guān)系實(shí)現分離,類(lèi)似于分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(SephadexG)、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝膠ToyopearlHW等。多糖的進(jìn)一步分離往往會(huì )選擇用各種凝膠進(jìn)行分離純化。選擇使用哪一種凝膠對多糖進(jìn)行純化的標準是多糖的分子量,不同種類(lèi)和型號的凝膠能夠分離多糖類(lèi)型和分子量范圍不同。凝膠柱的柱子規格常具有長(cháng)而細的特點(diǎn),直徑以1.6cm偏多。無(wú)論什么類(lèi)型的凝膠柱,流動(dòng)相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。

 

一、黃酮提取

(一)溶劑萃取法:

   黃酮苷和極性較大的苷元:甲醇,乙醇,甲醇-水(1:1),丙酮,乙酸乙酯。

    多糖苷:沸水

    花色苷:0.1%鹽酸進(jìn)行提取。

    苷元:氯仿,乙醚,乙酸乙酯。

   注意:苷類(lèi)提取防止酶解。

(二)堿提酸沉法

 常用堿水:石灰水,Na2CO3,稀NaOH,堿性稀醇。

    酸沉:鹽酸

注意:酸堿濃度不宜過(guò)高。

(三)炭粉吸附法:適于苷類(lèi)的精制。大部分可被7%酚-水洗下。

二、分離方法

分離的基本依據:

極性差異、酸性強弱、分子大小和特殊結構。

(一)柱色譜法

1、硅膠柱色譜法

適于分離異黃酮,二氫黃酮(醇)和高度甲基化或乙?;狞S酮及黃酮醇類(lèi)。

    分離苷元時(shí):氯仿-甲醇混合溶劑洗脫。

    分離苷時(shí):氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水

2、聚酰胺柱色譜

規律:

A:苷元相同時(shí),以含水移動(dòng)相洗脫,被吸附的強弱順序為:  苷元>單糖苷>雙糖苷>雙糖鍵苷。

B:與酚羥基的數目有關(guān),數目越多,吸附力越強。與酚羥基的位置有關(guān),如果酚羥基所處的位置易形成分子內氫鍵,則吸附力減弱。

C:不同類(lèi)型黃酮類(lèi)化合物,被吸附的強弱順序為:黃酮醇>黃酮>二氫黃酮>異黃酮。  

D:分子內芳香化程度越高,共軛雙鍵越多,則吸附力越強。

查耳酮>二氫黃酮,  黃酮>二氫黃酮

3、葡聚糖凝膠色譜法

   凝膠類(lèi)型:Ssephadex LH-20和Sephadex G兩種類(lèi)型的凝膠。分離苷元時(shí):利用吸附作用,游離酚羥基數目越多,則吸附力越強,越難洗脫。分離苷時(shí):主要靠分子篩,洗脫時(shí)按苷分子量由大到小的順序依次被洗脫出柱體。

黃酮類(lèi)化合物              取代基                 Ve/Vo

芹菜素                  5,7,4‘-三羥基         5.3

木犀草素          5,7,3‘,4’-四羥基          6.3

槲皮素            3,5,7,3',4'-五羥基           8.3

楊梅素       3,5,7,3‘,4’,5‘-六羥基         9.2

山柰酚-3-鼠李糖基        三糖苷                 3.3

   半乳糖-7-鼠李糖苷

槲皮素-3-蕓香糖苷        雙糖苷                 4.0

槲皮素-3-鼠李糖苷         單糖苷                 4.9

常用的洗脫劑:堿性水溶液,含鹽水溶液、醇及含水醇

(二)PH梯度法:用不同濃度的堿分離

(三)硼酸絡(luò )合法     具有鄰二酚羥基的黃酮類(lèi)化合物可與硼酸絡(luò )合生成易溶于 水的化合物

 

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